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種々の濃度のVNをプレートにコートしたあと、100nMのHKaおよびHKa−derivatives(rHRD,Light−chain)を細胞と一緒にプレートにincubationした。3時間後、伸展細胞を測定した。1μg/mlVNへの細胞伸展を100%とした。
図5 HKaの抗細胞接着抑制domainの同定
VN(1μg/ml)をにコートしたプレートに、HKaとKininogen−derivatives(rHRD,LK)をcoincubationし、細胞伸展を測定した。(A)VNへの細胞伸展;(B)HKaを細胞と一緒に加えた場合;(C)HKa+r−HRDを細胞と一緒に加えた場合;(D)HKa+LKを細胞と一緒に加えた。
図6 r−HRDを基質とした細胞接着
r−HRD(30μg/ml)をplatesにcoatingし、3T3 fibroblasts(4x103)の接着を検討した。興味深いことは、3T3 cellsは著明な接着伸展を示した(Asakura et al.文献より)。a:BSAへの細胞接着
b:r−HRD(1μg/ml);c:r−HRD(10μg/ml)への細胞伸展
図7 サンドイッチELISA法によるHKの測定
10μg/mlのMAb(15−1)をprecoatingしたプレートヘ種々の濃度のHKを2時間incubationした。3回TBSで洗浄したあと、HRPO−conjugated MAb(351)(10μg/ml)を加え2時間incubationした。その後、peroxidase基質により発色させた。
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